QX200數(shù)字PCR儀采用第三代PCR技術(shù)，能夠?qū)NA或RNA分子進(jìn)行絕對(duì)定量分析，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可直接獲得靶標(biāo)分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該系統(tǒng)具有高靈敏度、高精確度和高重復(fù)性，廣泛應(yīng)用于癌癥生物標(biāo)志物研究、病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析等領(lǐng)域。

　　一、操作前準(zhǔn)備

　　1.設(shè)備檢查與預(yù)熱：QX200數(shù)字PCR儀開機(jī)前需檢查電源連接是否牢固并可靠接地。先打開電源，預(yù)熱至少30分鐘后打開電腦和QuantaSoft軟件。建議每次實(shí)驗(yàn)之前做一次Flush System，若一周以上未使用建議先做一次Prime再做Flush System。

　　2.耗材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備DG8 Cartridges（微滴發(fā)生卡）、DG8 Gaskets（密封墊）、Droplet Generator oil（微滴生成油）、ddPCR Supermix預(yù)混液、Pierceable Foil Heat Seal（熱封膜）等耗材。

　　二、反應(yīng)體系配制

　　1.探針法反應(yīng)體系：配制20ul探針法定量反應(yīng)體系，選用適宜的探針法預(yù)混液。推薦終濃度900nM Primer+250nM Probe，振蕩混勻，離心除氣泡。注意20ul體系中所加樣本核酸含量不要超過規(guī)定檢測(cè)范圍。

　　2.染料法反應(yīng)體系：選用QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，推薦終濃度100nM Primer，單孔模板檢測(cè)范圍為1~30000拷貝片段化核酸或1~20000拷貝完整基因組DNA。用質(zhì)粒作為模板時(shí)建議酶切以消除復(fù)雜結(jié)構(gòu)，做CNV實(shí)驗(yàn)時(shí)必須對(duì)DNA模板進(jìn)行高頻酶切。

　　三、微滴生成步驟

　　1.放置耗材：將一個(gè)新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口方向。將20ul樣品反應(yīng)體系加入到DG8 cartridge中間一排的8個(gè)孔內(nèi)，不足8個(gè)樣品時(shí)用稀釋一倍的20ul 1×buffer control補(bǔ)足。建議使用Rainin的8通道20ul排槍和20ul槍頭，加樣時(shí)槍頭接近孔一側(cè)底部，與側(cè)壁呈約15°角，緩慢打出液體。

　　2.加入微滴生成油：在DG8 cartridge最底下一排8個(gè)孔中各加入70ul微滴生成油（DG Oil），同樣不能有空著的孔。蓋上膠墊（gasket），注意兩邊的小孔都要鉤牢。

　　3.生成微滴：將holder輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般2分鐘之內(nèi)完成。微滴生成于cartridge最上面一排孔內(nèi)，建議使用Rainin的8通道P-50排槍和200ul槍頭小心緩慢吸取，調(diào)整吸取體積為40ul。

　　四、PCR擴(kuò)增與封膜

　　1.轉(zhuǎn)移油滴：將holder放平，槍頭以與孔壁呈30~45°角放入，輕觸孔底約5秒吸取40ul，再同樣緩慢地打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)約5秒，槍頭貼近孔壁接近孔底。注意封上蓋以防油揮發(fā)，每次棄去已使用過的cartridge和膠墊。

　　2.熱封處理：轉(zhuǎn)移油滴進(jìn)入96孔板內(nèi)完成后，將膜有紅線標(biāo)記的一面（反光亮面）朝上置于96孔板上并固定好，用預(yù)熱好的PX1熱封儀對(duì)其進(jìn)行封膜。推薦的運(yùn)行程序?yàn)?80℃、5-10秒，無需顛倒方向進(jìn)行二次封膜。

　　3.PCR反應(yīng)：封好膜之后應(yīng)該在30分鐘內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，或者放于4℃冰箱4小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行PCR，可在任意一臺(tái)96孔PCR儀上完成，注意升降溫速度≤2.5℃/s。探針法推薦反應(yīng)條件：95℃ 10min；94℃ 30s 40循環(huán) Tm；98℃ 10min。

　　五、微滴檢測(cè)與分析

　　1.樣品板放置：將之前完成PCR的96孔板放入plate holder中組裝好，注意板斜角方位。組裝好之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中。

　　2.軟件操作：打開QuantaSoft軟件，對(duì)96孔板中樣品信息進(jìn)行Setup，主要是提供實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)類型（ABS、CNV、RED）、assay以及探針信息等。完成后即可進(jìn)行Run，結(jié)束后結(jié)果會(huì)被自動(dòng)Analyze，人工核實(shí)修正后保存結(jié)果，即完成了一次QX200實(shí)驗(yàn)。
 

　　六、注意事項(xiàng)

　　1.樣品質(zhì)量要求：RNA或反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣本，樣本cq值應(yīng)>28；DNA樣本需進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，總量不超過100000個(gè)拷貝；自帶引物和探針，熒光染料法引物工作濃度100nM，探針法引物濃度900nM、探針濃度250nM。

　　2.操作規(guī)范：加樣時(shí)避免引入氣泡，不要將槍打至第一檔位置；微滴生成過程中注意指示燈狀態(tài)；封膜后應(yīng)盡快進(jìn)行PCR反應(yīng)；使用配套的AutoDG吸頭，其他品牌吸頭會(huì)對(duì)儀器造成損傷。

　　QX200數(shù)字PCR儀通過將反應(yīng)體系分割為大量獨(dú)立微滴，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)分子的絕對(duì)定量，具有無需標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，是生命科學(xué)研究中的重要工具。